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    TA克隆實驗原理 

  • 發布日期:2016-09-12      瀏覽次數:7284
    •     TA克隆實驗原理
          TA克隆是利用耐熱聚合酶,如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉移酶活性,而不具有3 一5外切酶的校準活性,即在PCR產物的兩個3 末端加上未配對的單一A凸出尾 ,質粒載體提供線性3末端單一的T凸出尾,使該載體能夠直接與PCR產物連接。TA克隆技術比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。
          TA克隆只需4個步驟:①擴增目的PCR產物;②制備T克隆載體;③PCR產物直接克隆至T載體上④轉化并篩選重組子。
          TA克隆實驗步驟
          (1)擴增后的PCR產物與T載體的連接
          取1只無菌Ep管、用微量進樣器按下列順序加入各成分。
          10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul
          PCR產物約0.3 pmol
          T載體約0.03pmol
          T4 DNA Ligase 1ul
          ddH2O 加至 25ul
          *1 DNA的摩爾數應控制在載體DNA摩爾數的3-10倍。
          *2 相同末端的載體與DNA進行連接時,應首先將載體進行去磷酸化處理,以防止其自身環化。
          (2)蓋好蓋子,用手指輕彈Ep管數次,并于臺式離心機離心2s 以集中溶液。
          (3)將反應管放入4℃金屬浴中反應20h。
          (4)取出約2ul的DNA連接液進行瓊脂糖凝膠電泳,鑒定連接結果,與未經連接的質粒DNA和酶切DNA一同作電泳。
          (5)用0.1×TE將連接混合物稀釋至50ul,使用10ul轉化大腸桿菌感受態細胞。
          (6)通過Amp抗性來篩選轉化子,轉化子擴增后,可將轉化的質粒提取出,進行電泳、酶切等進一步鑒定。
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