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    TA克隆(TA-cloning)

  • 發布日期:2013-11-09      瀏覽次數:5625
    •      TA克隆(TA-cloning)是利用Taq聚合酶的特性將PCR產物克隆的方法,又稱為T-載體克隆

           Taq DNA聚合酶在四種dNTP存在下可以向非特性的PCR產物的3’末端特異性的添加一個A。這也成為Taq酶催化的PCR產物不能的連接至平末端載體的主要原因。相反地,如果此時有一個線性的帶有粘性T末端的載體DNA(T載體),那么帶有A粘性末端的PCR產物就可以的插入載體DNA中。這種方法被稱為TA克隆。

       

      實驗材料

      Invitrogen公司提供的TOPO 快速TA 克隆試劑盒。我們采用pCR®II-TOPO®體系。

      內含TOPO TACloning® reagents (Box 1) 和 One Shot® Chemically Competent cells (Box 2).

      TOPO 反應鹽溶液:200 mM NaCl,10 mM MgCl2。

       

      實驗步驟

       

      總體步驟:

      PCR 反應

      進行TOPO反應,連接PCR產物與TOPO載體

      用連接好的TOPO克隆轉化TOPO感受態細胞

      藍白斑篩選

       

      細節

      1、PCR 反應

      按正常步驟用Taq聚合酶進行PCR反應循環。

       

      2、進行TOPO反應,連接PCR產物與TOPO載體

      在反應體系中加入如下反應物:

      新鮮的PCR產物1ul

      TOPO反應鹽溶液 1ul

      無菌水 4ul

      TOPO® vector 1ul

      共 6ul

      輕輕混合以上反應物,在室溫(22oC-23oC)溫育5分鐘。

      將以上反應物置于冰上,進行轉化

       

      3、用連接好的TOPO克隆轉化TOPO感受態細胞

      向試劑盒提供的 One Shot® Chemically Competent E. coli中加入2ul以上反應液,輕輕混勻。在冰上進行轉染10分鐘。

      在42oC下熱刺激細胞30秒,然后馬上轉移至冰上。

      向體系中加入250ul 室溫下的SOC 培養液。

      水平離心轉化管(200rpm, 37oC)1小時。

      用10~50ul 轉化液向預熱的培養基鋪板。

       

      4、藍白斑篩選

      取出10個白色或淺藍色的菌落在含有50ug/ml卡那霉素或氨芐青霉素LB培養基中培養。

      提純質粒,進行鑒定。

       

       

      其中的T載體可以用以下三種方法構建

      Ø 一種載體可以用限制性內切酶如XcmI, HphI, 與MobII 酶切消解產生,3‘末端未配對的T。

      Ø 應用末端轉移酶與雙脫氧TTP加入一個突出的T殘基到線形化載體的3’末端。

      Ø 應用不依賴末端的Taq DNA聚合酶的末端轉移酶活性在線形化載體的3‘末端出的羥基基團上催化連接上一個T堿基。

       

          但是并非所有可用于PCR的耐熱DNA聚合酶都具有非模版依賴的A添加能力。例如常用于高精度PCR反應的Pfu 聚合酶只能產生平末端,因而不能夠用于TA克隆。

       

           目前,T載體可以從許多供應商那里購買得到克隆化的試劑盒,如pCR-Script[SK+](from Statagene 公司),PCRII的TA克隆試劑盒(from Invitrogen 公司),PGEM-T (from Promega 公司)等等。

       

          以下以PCRII的TA克隆試劑盒(from Invitrogen 公司)為例講述TA cloning 的過程:

          從牛痘病毒(Vaccinia)中提取的DNA拓撲異構酶1可以識別5’-CCCTT序列,并連接5’-CCCTT和外源DNA(Shuman, 1991,1994),因而可用于TA cloning。

       

      參考文獻

      1. Joseph Sambrook,David W Russell. Molecular cloning(3rd edition)

      2. Shuman, S. (1991).  Recombination Mediated by Vaccinia Virus DNA Topoisomerase I in Escherichia coli is Sequence Specific. Proc. Natl. Acad. Sci. 

      3. Holton TA, Graham MW.  A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.  Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19(5):1156

      4. Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS.  Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19(5):1154.

      5. Borovkov AY, Rivkin MI.  XcmI-containing vector for direct cloning of PCR products. Biotechniques. 1997 May;22(5):812-4. 

      6. Kovalic D, Kwak JH, Weisblum B.  General method for direct cloning of DNA fragments generated by the polymerase chain reaction.  Nucleic Acids Res. 1991 Aug 25;19(16):4560. 

      7. Hengen PN.  Fidelity of DNA polymerases for PCR. Trends Biochem Sci. 1995 Aug;20(8):324-5. 

      8. Leal, J.F.M.; López-Barea, J.; Dorado, G.  T-vector cloning and high performance PCR with SuperTth from Thermus thermophilus  Genetic Analysis: Biomolecular Engineering Volume: 12, Issue: 2, October, 1995, pp. 119-121  

      9. Hoover C, 1998 July 8. Invitrogen web catalog.  Accessed 1999 Feb 14.

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