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    簡述DNA甲基化檢測

  • 發布日期:2013-11-22      瀏覽次數:4883
    •     DNA甲基化是哺乳類動物一個重要的基因外遺傳信號。有研究表明,DNA甲基化與大多數腫瘤的發生相關,抑癌基因啟動子CpG島的高度甲基化可引起抑癌基因表達沉默,細胞出現無節制生長,導致腫瘤的發生。目前,基因的甲基化研究主要結合亞硫酸氫鈉處理和PCR技術,分為甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR,MSP)和硫化測序PCR(Bisulfite sequencing PCR, BSP)。 

       

      甲基化特異性的PCR(MSP)原理

           雙鏈DNA變性解鏈后,在HSO3-作用下發生C→U轉化,C若已有甲基化則無此改變;甲基化修飾只發生于5′→3′方向C-G相聯結構的C上,因此在HSO3-作用后,DNA CpG島若無甲基化,則序列中的改變為C→U,CG→UG,若有甲基化則為C→U,CG→CG,用不同的引物做PCR,即可檢測出這種差異,從而確定基因有無CpG島甲基化。從理論上說,DNA發生甲基化的MSP產物的序列與原序列比較,變化為C→T,CG→CG,相應其互補鏈的改變為G→A,CG→CG。然后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物并進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增,zui后通過瓊脂糖凝膠電泳分析,確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態。MSP法靈敏度較高,應用范圍廣。

       

      硫化測序PCR(BSP)原理:

          結合重亞硫酸鹽的測序法是一種靈敏的能直接檢測分析基因組DNA甲基化模式的方法。重亞硫酸鹽處理后,用針對改變后的DNA序列設計特異性引物并進行聚合酶鏈式反應(PCR)。 PCR產物中原先非甲基化的胞嘧啶位點被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位點保持不變。PCR產物克隆后進行測序。通過這個方法能得到特定位點在各個基因組DNA分子中的甲基化狀態。

       

      甲基化服務流程

      1)   根據目的基因啟動子序列設計相應引物;
      2)   基因組DNA的提取和定量;
      3)   亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA;
      4)   修飾后DNA純化回收;
      5)   a、結合實時定量PCR的qMSP;
              b、BSP,對PCR產物進行測序并與未經處理的序列比較;
      6)   數據處理;
      7)   向客戶提交數據分析結果與實驗報告。

       

      樣品要求:

          盡可能新鮮和足量的組織(≥50mg)、細胞樣品(≥106)或全血(≥300μl),或直接提供純化好的DNA(≥5μg/樣品)。

       

      基因甲基化檢測

          甲基化是在DNA甲基轉移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基,在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環的五號碳原子上加上甲基的共價修飾過程.

          DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式,它不改變DNA的一級結構,卻在細胞的發育、基因的表達、及基因組的穩定性中起著重要的作用。

          CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現象,而啟動子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機制。

          因此,基因啟動子甲基化檢測在臨床診斷(如甲基化檢測與低劑量CT相結合)、藥物敏感性檢測等方面具有很高的應用價值。

          目前甲基化特異性PCR(Methylmion Specific PCR,MSP)及其改進方法是檢測基因甲基化的經典方法.MSP法的原理是首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA,所有未發生甲基化的胞嘧啶都被轉化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶則不變。然后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物并進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增,zui后通過瓊脂糖凝膠電泳分析,確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態。

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