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    熒光定量PCR檢測(cè)服務(wù)-SYBR染料法

    簡要描述:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前已得到廣泛應(yīng)用;實(shí)時(shí)熒光定量PCR:在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,Z后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

    • 產(chǎn)品型號(hào):
    • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
    • 更新時(shí)間:2024-05-13
    • 訪  問  量:5538

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time Quantitative PCR)

    在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。相對(duì)定量用于測(cè)定一個(gè)測(cè)試樣本中目標(biāo)核酸序列與校正樣本中同一序列表達(dá)的相對(duì)變化。校正樣本可以是一個(gè)未經(jīng)處理的對(duì)照或者是在一個(gè)時(shí)辰研究中處于零時(shí)的樣本。

    相對(duì)定量應(yīng)用(Relative Quantification,RQ)

    非特異性熒光標(biāo)記:

    1、SYBR Green

       SYBR Green特性:

    (1)只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。

    (2)變性時(shí),DNA雙鏈分開,無熒光。

    (3)在延伸結(jié)束階段采集熒光信號(hào)。

    (4)SYBR Green也能和非特異性的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光,所以必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做熔解曲線分析。

    相對(duì)定量通過內(nèi)標(biāo)定量:
    內(nèi)標(biāo)(Endogenous Control)通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因,在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定,受環(huán)境因素影響小,內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量。

     

    相對(duì)定量分析方法:

    2-ΔΔCt
    前提:目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100%且偏差在5%以內(nèi)
      1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值:
        ΔCT(test)= CT(target,test)-CT(ref,test) 
        ΔCT(calibrator)= CT(target,calibrator)-CT(ref, calibrator) 
      2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT值:
             ΔΔCT= ΔCT(test) - ΔCT(calibrator)
      3、計(jì)算表達(dá)水平比率:
                        2 –ΔΔCT=表達(dá)量的比值

    服務(wù)流程:

    步驟

    客 戶 提 供

    服 務(wù) 內(nèi) 容

    基 屹 提 供

    1新鮮的且盡量多的材料;已知的全長基因序列;盡可能詳細(xì)的背景資料:DNA/ RNA來源、豐度等。DNA/RNA提取,根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。 
    2純化好的DNA/RNA(大于5 ug/樣品);已知的全長基因序列;盡可能詳細(xì)的背景資料:DNA/ RNA來源、豐度等。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。 
    3 以DNA為模板,對(duì)目的基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)分析提供完整的定量分析結(jié)果、實(shí)驗(yàn)熒光定量擴(kuò)增曲線及詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟。

    注意:客戶可根據(jù)所能提供的起始材料不同,選擇從步驟1或2啟動(dòng)項(xiàng)目。

     

     

     

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