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    TA克隆

    簡(jiǎn)要描述:TA克隆(clone):無(wú)性繁殖——應(yīng)用酶學(xué)的方法,在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成具有自我復(fù)制能力的DNA分子(重組子),再通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因轉(zhuǎn)化子,進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA,或其表達(dá)產(chǎn)物。

    • 產(chǎn)品型號(hào):
    • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
    • 更新時(shí)間:2024-05-13
    • 訪  問  量:4781

    TA克隆實(shí)驗(yàn)原理 

      TA克隆是利用耐熱聚合酶,如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉(zhuǎn)移酶活性,而不具有3 一5外切酶的校準(zhǔn)活性,即在PCR產(chǎn)物的兩個(gè)3 末端加上未配對(duì)的單一A凸出尾 ,質(zhì)粒載體提供線性3末端單一的T凸出尾,使該載體能夠直接與PCR產(chǎn)物高效連接。技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

    只需4個(gè)步驟:①擴(kuò)增目的PCR產(chǎn)物;②制備T克隆載體;③PCR產(chǎn)物直接克隆至T載體上④轉(zhuǎn)化并篩選重組子。

     

    實(shí)驗(yàn)步驟

    (1)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物與T載體的連接

    取1只無(wú)菌Ep管、用微量進(jìn)樣器按下列順序加入各成分。

    10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

    PCR產(chǎn)物約0.3 pmol

    T載體約0.03pmol

    T4 DNA Ligase 1ul

    ddH2O 加至 25ul

    *1 DNA的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3-10倍。

    *2 相同末端的載體與DNA進(jìn)行連接時(shí),應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理,以防止其自身環(huán)化。

    (2)蓋好蓋子,用手指輕彈Ep管數(shù)次,并于臺(tái)式離心機(jī)離心2s 以集中溶液。

    (3)將反應(yīng)管放入4℃金屬浴中反應(yīng)20h。

    (4)取出約2ul的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,鑒定連接結(jié)果,與未經(jīng)連接的質(zhì)粒DNA和酶切DNA一同作電泳。

    (5)用0.1×TE將連接混合物稀釋至50ul,使用10ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

    (6)通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后,可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出,進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。

     

     

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