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    TA克隆

    簡要描述:TA克隆(clone):無性繁殖——應用酶學的方法,在體外將目的基因與載體DNA結合成具有自我復制能力的DNA分子(重組子),再通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因轉化子,進行擴增、提取獲得大量同一DNA,或其表達產物。

    • 產品型號:
    • 廠商性質:生產廠家
    • 更新時間:2024-05-13
    • 訪  問  量:6160

    TA克隆實驗原理 

      TA克隆是利用耐熱聚合酶,如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉移酶活性,而不具有3 一5外切酶的校準活性,即在PCR產物的兩個3 末端加上未配對的單一A凸出尾 ,質粒載體提供線性3末端單一的T凸出尾,使該載體能夠直接與PCR產物高效連接。技術比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

    只需4個步驟:①擴增目的PCR產物;②制備T克隆載體;③PCR產物直接克隆至T載體上④轉化并篩選重組子。

     

    實驗步驟

    (1)擴增后的PCR產物與T載體的連接

    取1只無菌Ep管、用微量進樣器按下列順序加入各成分。

    10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

    PCR產物約0.3 pmol

    T載體約0.03pmol

    T4 DNA Ligase 1ul

    ddH2O 加至 25ul

    *1 DNA的摩爾數應控制在載體DNA摩爾數的3-10倍。

    *2 相同末端的載體與DNA進行連接時,應首先將載體進行去磷酸化處理,以防止其自身環化。

    (2)蓋好蓋子,用手指輕彈Ep管數次,并于臺式離心機離心2s 以集中溶液。

    (3)將反應管放入4℃金屬浴中反應20h。

    (4)取出約2ul的DNA連接液進行瓊脂糖凝膠電泳,鑒定連接結果,與未經連接的質粒DNA和酶切DNA一同作電泳。

    (5)用0.1×TE將連接混合物稀釋至50ul,使用10ul轉化大腸桿菌感受態細胞。

    (6)通過Amp抗性來篩選轉化子,轉化子擴增后,可將轉化的質粒提取出,進行電泳、酶切等進一步鑒定。

     

     

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